多光子成像技术的发展历程

在生物医学领域，了解微观世界的奥秘对于攻克疾病、探索生命本质至关重要。光学成像技术作为重要的研究手段，不断推陈出新。其中，新型多光子成像技术近年来发展迅猛，为科研人员和医疗工作者提供了更为强大的观测工具。它能够深入活体组织内部，获取高分辨率的图像，帮助我们窥探细胞和组织的细微结构与动态变化。

传统光学成像技术在生物医学研究和临床诊断中发挥了重要作用，但也存在诸多局限性。例如，在观察深层组织时，光的散射和吸收会导致成像质量下降，分辨率降低，难以清晰呈现组织内部的微观结构。而且，传统成像技术可能对组织造成较大的光损伤，影响细胞的正常生理功能，干扰研究结果的准确性。这些局限限制了我们对生物体内复杂过程的深入理解，迫切需要新的成像技术来突破这些瓶颈。

随着科学技术的不断进步，多光子成像技术应运而生。它基于多光子吸收原理，与传统成像技术相比，具有独特的优势。多光子成像能够有效减少光散射和吸收，降低组织光损伤，提高成像的信噪比，并且具备良好的光学层析成像能力，为生物医学研究带来了新的希望。接下来，我们将详细介绍几种新型多光子成像技术。

技术原理与发展历程：微型化双光子荧光成像技术是为满足对神经系统在体研究的需求而发展起来的。神经系统结构复杂，研究其活动需要在尽量保持其完整性的情况下进行成像。双光子荧光成像利用近红外光激发，具有深组织穿透性、光学切片能力以及较小的光毒性和光漂白等优势，成为无创在体脑显微成像的首选。第一台微型化双光子显微镜原型机于2001年问世，采用单模光纤尖端扫描，但存在质量重、扫描频率受限和难以批量生产等问题。2006年，微机电系统（MEMS）扫描镜被引入，一定程度上改善了性能，但仍存在无法对重要荧光探针成像和实际工作性能不佳等问题。

携带式双光子显微镜

最新进展与优势：北京大学程和平课题组报道的高速高分辨微型化双光子显微镜（FHIRM-TPM）代表了该技术的最新进展。它采用MEMS扫描镜设计，对配件进行改进和创新，这款显微镜重量仅2.15g，横向分辨率和轴向分辨率分别提升约一倍，能有效激发常用荧光指示剂，可在小鼠活跃运动状态下长时间稳定工作。

二维MEMS扫描镜的显微照片

应用领域：微型化双光子显微镜主要用于脑成像，能够在动物自由活动状态下研究神经活动，为神经科学研究提供了有力工具。未来，它有望拓展应用于更多组织成像，通过更换物镜适应不同成像需求，还可与微创方法结合实现更深层脑成像，或借助新兴三光子技术提升成像效果。

技术优势与分类：双光子光纤内窥成像技术为早期癌症局部微创诊断提供了新途径。双光子激发只发生在焦点附近，激发光波长更长，散射更少，能穿透更深标本，提高图像对比度，还可通过分析非线性信号了解内部器官生理、病理变化。该技术的内窥镜按光纤类型分为单模光纤（SMF）、光子晶体光纤（PCF）和双包层光纤（DCF）。单模光纤最早应用，但存在脉冲变宽和难以收集非线性信号的缺点。光子晶体光纤能提高激发光束传递和非线性信号采集效率，双包层光纤便于实现内窥镜微型化。

光纤横截面示意图

扫描装置与发展成果：研究者通过改良扫描装置提高成像速度和质量，多种微型扫描机构已被应用。随着技术发展，双光子内窥成像在科研和临床应用中取得较大进展，如对癌细胞成像、大脑深部成像、上皮组织成像以及对大鼠食管组织和尾腱成像等。

扫描方式

微型物镜与纵向聚焦位移

最新进展与应用前景：2017年，Liang WX等人实现了具有亚细胞层次分辨率的光纤内窥平台，可对活体内生物组织进行无标记双光子代谢成像。该装置在光纤、物镜和激发效率等方面进行改进，提高了检测灵敏度、空间分辨率和图像质量，整体信噪比提高20-50倍。它能够监测急性小鼠肾缺血再灌注体内模型中肾皮质小管的氧化还原率变化，展现了高分辨率和高灵敏度。未来，双光子光纤内窥成像技术将朝着提高成像速度和信噪比的方向发展，在临床实践中的应用也将更加广泛。

发展历程与原理：三光子成像技术的发展经历了漫长过程。研究者们很早就观察到三光子吸收激发荧光现象，1979年Catalano等人对无机材料的三光子非线性光学性质进行定量分析，1995年Davey等人在有机高分子聚合物溶液中观察到三光子激发荧光现象并提出应用设想。随后，一系列研究验证了三光子成像的能力，但受光源技术和成本限制，发展较为缓慢。直到2013年，Horton等人报道了使用基于孤子自频移（SSFS）光源的三光子显微镜，使三光子成像取得重要突破。

SSFS光源及三光子激光扫描显微镜示意图

与双光子成像的比较：与双光子成像相比，三光子成像使用波长更长的激发光源，成像深度更大。这是因为长波激发光在组织中的散射更低，且1600-1800nm的激发光可避开组织中水对红外光的吸收峰。同时，三光子吸收需要更高激光能量，能进一步削弱非焦平面的背景信号，提高信号-背景比（SBR），获得更高质量图像。不过，三光子成像也存在缺陷，如对高能激发光需求导致设备成本和技术难度增加，强激光可能对组织造成损伤。

应用领域与发展方向：目前，三光子成像主要应用于活体组织高分辨成像和光遗传学研究等领域，未来有望应用于临床光学治疗。为克服现有缺陷，研究人员正通过开发新型荧光染料、寻找合适激光光源和优化探测器等方法，提高三光子成像深度、分辨率和信号强度。

微型化双光子显微镜（如FHIRM-TPM）在脑成像实验中表现出色。在对小鼠的研究中，它能够清晰捕捉小鼠活跃运动状态下神经元的活动情况。通过有效激发荧光，科研人员可以观察到神经元的形态和功能变化，为研究神经回路的动态过程提供了直观的数据。与传统台式双光子显微镜相比，FHIRM-TPM的高分辨率和高扫描速度，使其能够更精准地记录神经元活动的时空信息，有助于深入理解神经系统的工作机制。

FHIRM-TPM结构及外观

双光子光纤内窥成像技术在生物组织代谢成像方面成果显著。以对急性小鼠肾缺血再灌注体内模型的研究为例，通过无标记双光子内窥技术监测肾皮质小管的氧化还原率变化。实验结果显示，缺血时NADH浓度增加，氧化还原比下降，再灌注后恢复正常。从成像图像中可以清晰看到，缺血后红色区域氧化还原比下降，再灌注后红色区域变成绿色，直观展示了双光子内窥显微成像的高分辨率和高灵敏度，为研究肾脏生理病理过程提供了有力依据。

鼠肾脏缺血-再灌注体内模型双光子荧光内窥成像

三光子成像技术在大脑成像实验中展现出独特优势。使用基于SSFS光源的三光子显微镜对小鼠大脑进行成像，可以无损地看到大脑灰质之下的白质。与双光子成像相比，三光子成像能够穿透更深的组织，获得更清晰的深层结构图像。在对神经元和脑血管的成像中，三光子成像的高SBR使得图像中的细节更加丰富，有助于研究人员深入了解大脑的结构和功能关系，为神经科学研究开辟了新的视角。

三光子成像结果图

新型多光子成像技术在生物医学领域意义重大。微型化双光子成像技术让科学家能在动物自由活动时研究神经系统，为解开大脑奥秘提供关键数据，推动神经科学发展，未来有望拓展到更多组织成像，帮助理解多种生理病理过程。双光子内窥成像技术可实现无创或微创的体内检测，提高疾病早期诊断准确性，降低患者痛苦和医疗成本，未来提高成像速度和信噪比后，将在临床广泛应用，助力疾病早筛和精准治疗。三光子成像技术凭借大成像深度和高SBR，在研究深层组织和细胞结构功能方面优势明显，随着技术完善，有望为临床光学治疗提供新方法，提高治疗效果。

声明：本文仅用作学术目的。

石玉洁, 张广杰, 陆政元, 应亚宸, 贾荟琳, 席鹏. 新型多光子成像技术研究进展[J]. 中国光学（中英文）, 2018, 11(3): 296-306. 

DOI:10.3788/CO.20181103.0296.