先进成像 | 单物镜光片显微镜三维荧光成像技术研究进展

光片显微镜由于具有强大的光学层切能力、较快的成像速度和较低的光损伤，成为三维成像的重要工具。光片显微镜通常利用两个垂直放置的物镜分别进行照明和成像，这带来了对样品的空间限制并禁用了高数值孔径的成像物镜。以倾斜平面照明和微镜微器件反射技术为代表的单物镜光片显微技术突破上述限制，展示出在高分辨率和体积高速成像方面的优势，并且可与超分辨显微术等多种技术结合，在近年来取得了巨大发展。

本文介绍了不同类型的单物镜光片显微成像技术的原理、关键性能的提升和其在生物医学的应用。

1.1 倾斜平面照明显微镜的实现原理

传统的选择平面照明显微镜由两个正交的物镜构成，双物镜的放置占用了几何空间，不适用于盖玻片样品的成像。使用一物镜引入光片的同时使用另一个相同物镜进行成像则可以解决上述问题。Konopka等设计了可变角度的落射光荧光显微镜，使用与成像同一个高NA的物镜输出可变角度的倾斜照明光，减少了荧光背景，提高了信噪比。

Tokunaga等利用高度倾斜和层压光学片显微镜，使用细的倾斜光束对细胞中的单个分子进行成像。这样斜入射的照明光可以增加图像的对比度，降低了光漂白程度，但这种显微镜照明光束从物镜光瞳边缘入射，照明方向与焦平面成一定倾斜角度，由于倾斜面像差的存在，真正能用于成像的只有焦平面与照明光束所相交的那条“线”，而不是面。

图1 倾斜平面照明显微镜光路，用同一物镜生成光片并成像，引入远程聚焦系统修正照明角度倾斜

为了解决倾斜照明平面与焦平面不重合的问题，2008年Dunsby发明了倾斜光片照明显微镜。如图1所示，将柱透镜生成的片状照明光引入原先探测物镜的光路中，在成像光路中设计了一种远程聚焦系统，引入二级和三级物镜在无球差的条件下对样本三维信息在第二、第三物镜之间进行复制，再通过三级物镜进行成像。两台显微镜提供的总放大倍数在轴向和横向上都是相等的（折射率匹配）。

1.2 倾斜平面照明显微镜的生物医学应用

光片显微镜自出现以来，依靠极低的光毒性常被用于活体胚胎等大样本的长时间发育成像等。光片显微镜的成像限制也成了研究人员开发单物镜光片的初衷，单物镜光片显微镜的发展不仅增加了生命科学研究人员的使用便利性，也拓展了生命科学中多种之前不可能实现的场景中的应用，使光片显微镜在活体成像上的优势更为明显。

图2 倾斜平面照明显微镜用于快速生命活动成像。（a）OPM实现对心脏中钙火花的3D成像；（b）OPM实现对心肌收缩钙波传播的观测；（c）SCAPE 2. 0以321volume/s的体积成像速度实现对心脏与心房间的血流动力学观测

图3 OPM在生命科学与医学检查场景的广泛应用。（a）OPM的高分辨率成像；（b）OPM用于流式细胞检测；（c）DaXi-OPM实现对9个斑马鱼胚胎的同时成像；（d）Medi-SCAPE用于活体肿瘤检测；（e）利用人眼作为天然物镜，实现对眼底视网膜成像

单物镜光片显微镜将振镜扫描的方式带入光片显微镜的三维成像，将体积成像速度带入新的量级，使体积成像可以只受相机帧速限制。这在很多高速生命活动如神经活动、心脏跳动及血流动力学等方向需要毫秒级时间分辨率的观测是充满希望的。

倾斜平面显微镜是最普遍的单物镜的光片显微镜，但是存在倾斜切面引入非各向同性的PSF、需要额外的远程聚焦系统的问题，这使显微镜结构复杂化。除了倾斜照明平面显微镜，另一类的单物镜光片显微镜则借用了45°反射微镜，这一类光片显微镜用同一物镜发射垂直于光轴的照明光片，可以用CMOS/CCD直接成像，不再需要额外的远程聚焦系统。

2.1 针尖微悬臂反射镜

早先原子力显微镜悬臂的45°镜面的反射可以使光片与焦平面对准。2013年Gebhardt等开发了一款利用原子力显微镜（AFM）臂的反射型光片显微镜，斜入射的光片在壁上反射照明样品。受到悬臂反射的启发，2018年Ponjavic等利用原子力显微镜的单臂开发了一种只使用一个物镜的光片显微镜，将原子力显微镜的单臂当作反射界面，也实现了单物镜光片照 明。Li等将AFM的显微镜单物镜光片与纳米移液器结合，进行了精确单分子递送研究。这一类显微镜的优点是可以使用高NA物镜对多孔板进行成像，并且在移动位移台时不需要对样品进行重新聚焦。

2.2 微流控制备微反射镜器件

2015年Galland等设计了一款不需要远程聚焦系统、光片方向垂直于物镜光轴的单物镜光片显微镜，该单物镜光片显微镜的光路如图8（a）所示。该显微镜使用了一种定制的样品装载容器，将45°反射微镜结合在硅片的微孔里。照明光束从物镜后焦面上斜入射，经45°微镜反射后形成垂直于光轴的照明光片。该单物镜光片显微镜可以与倒置商用标准显微镜兼容，同时10×到100×物镜都可以使用，生成的光片厚度为1.5~5.2µm，可以方便多种尺度的研究。该系统既可以使用振镜扫描光片，如图4（a）所示y方向振镜扫描，也可以使用柱透镜生成静态光片。

超分辨显微术是一种突破传统显微镜分辨率极限的技术，可以将物体结构的分辨率提高到亚细胞水平。现代的超分辨显微术包括了多种技术，如激光受激发射显微术（STED）、包括stochastic optical reconstruction microscopy（STORM）和NA-based point accumulation for imaging in nanoscale topography（PAINT-DNA）等的单分子光学显微术（SMLM）、结构照明显微术（SIM）。依据瑞利判据可分辨的最小范围为200nm，而超分辨显微镜的出现突破了该极限，超分辨显微镜是近代光学显微镜中最浓墨重彩的一笔。光片的照明方式对多种超分辨方法具有潜在的增益，这十几年间二者深深地联系在了一起。

3.1 单物镜光片显微镜的单分子定位超分辨成像

典型的单分子方法如STORM的原理是：利用荧光染料的发光特性，对荧光染料以少量随机分布的方式激发，然后对发光的荧光染料单个分子进行定位。通过多次成像，将每个分子的位置累加起来，就可以得到分子分布的高分辨图像。单分子超分辨方法中，荧光信号是微弱的。图像的信噪比越高，单分子定位的精度就会越高。传统照明方法具有高背景荧光，高信噪比也是光片显微镜的优势之一。一般的单分子显微镜只能将成像范围限制在表面样品，但与光片显微镜结合后，可以将厚样本纳入研究范围。

3.2 单物镜光片显微镜的结构光照明超分辨成像

在上述几种超分辨成像方法中，SIM超分辨显微术具有相对较快的速度，与光片技术都常用于活细胞的成像场景。要想实现各向同性分辨率增益的结构光显微成像，则需要在三个方向上拍摄3张相位相差π/3的图像，利用9张图片重建获得超分辨图像。但如何在光片显微镜中实现频率满足周期性的条纹一直是一个难点。

图5 结合单分子定位方法的单物镜光片显微镜。（a）soSPIM-PLAM成像，左边宽场，右边超分辨；（b）soSPIM-dSTORM超分辨成像，左边宽场，右边超分辨；（c）组织深度为50μm的代表性体积obSTORM图像，十张图像堆叠，深度颜色编码；（d）obSTORM高倾斜角度的光片入射；（e）光片角度下理论和实验PSF的对比。