Biomed Opt Express | 近红外三区激发三光子荧光：穿透1550微米深度活体脑血管成像
本文研究探索了伊文思蓝（Evans blue）在近红外三区（NIR-III,1600–1840nm）窗口激发下用于小鼠脑血管三光子荧光（3PF）成像的可行性。通过系统表征其三光子作用截面（ησ₃）和体内外发射光谱，首次证实该染料在1720nm激发下可产生显著的三光子荧光信号，并成功实现了穿透深度达1550μm的活体脑血管成像，跨越灰质、白质层直至海马区。这一发现为深脑血管研究提供了安全、高效的荧光标记新方案。
重要研究者包括SHEN TONG, HONGJI LIU, JIE HUANG, JINCHENG ZHONG, JIEMEI YAN, HENG WANG, XIAO ZHANG, PING QIU, KE WANG，成果以《In vivo three-photon fluorescence imaging of mouse brain vasculature labeled by Evans blue excited at the NIR-III window》为题，2025年1月发表于《Biomedical Optics Express》。
重要发现
伊文思蓝的光学特性突破
1.三光子作用截面（ησ₃）的显著优势
实验通过对比磺基罗丹明101（SR101）参考试样，量化了伊文思蓝在NIR-III窗口的三光子效率。
结果显示：
在血浆环境中，伊文思蓝的ησ₃值高达520×10⁻⁸⁴cm⁶s²/photon²（1720nm激发），比SR101的参比值（65.5×10⁻⁸⁴cm⁶s²/photon²）提升近8倍。
水溶液中几乎无3PF信号（平均计数18），而血浆中信号强度达3126计数，证实其依赖血浆蛋白结合的特性。
伊文思蓝在水中（a）和血浆中（b）的3PF图像
2.波长依赖性与非线性验证
通过1600–1840nm波长扫描，证实荧光信号与激发功率呈三次方关系（斜率≈3）。
符合三光子过程特征：
1600nm激发斜率：3.11
1720nm激发斜率：3.01
1800nm激发斜率：2.97
体内3PF成像和3P发射光谱测量的实验装置
活体脑血管成像验证
1.体内外光谱一致性
通过多光子发射光谱系统测量活体脑血管与血浆样本的发射光谱，峰值均稳定于670nm，表明生理环境未显著改变其光学行为。
体内标记伊文思蓝的小鼠大脑三光子发射光谱测量
2.代谢稳定性
注射1小时后，血管内3PF信号强度保持稳定，印证其"不易代谢"特性，适合长时程成像。
用伊文思蓝标记的血管的3PF信号随时间的变化
穿透深度与分辨率突破
使用1720nm激发光源和高数值孔径物镜，实现：
1550μm深度成像：跨越灰质（300–900μm）、白质（950–1150μm）至海马区。
高对比度：信背比（SBR）从300μm处的500:1降至1550μm处的5:1，海马区仍达13:1。
微血管分辨：40μm深度血管直径精确测量为2.2μm，验证亚细胞级分辨率。
小鼠脑血管的体内多光子显微镜成像
1720nm激发下血管直径的表征
创新与亮点
突破深脑成像技术瓶颈
1.首探NIR-III窗口染料适用性
首次将伊文思蓝——传统用于血脑屏障评估的低毒染料——拓展至NIR-III窗口三光子成像，填补该波段小分子探针的空白。
2.三重穿透增强策略
结合长波长激发（1720nm）、三阶非线性效应和高ησ₃探针，穿透深度较传统双光子（2PF）提升近2倍，突破白质散射屏障。
安全高效的临床潜力
1.低毒免代谢优势
利用伊文思蓝的血浆蛋白结合特性与生物惰性，避免基因改造或纳米颗粒潜在毒性，为活体研究提供更安全方案。
2.多尺度结构解析
从皮层微血管（2.2μm）至海马大血管，单次成像覆盖全脑血管层级，助力脑疾病血管机制研究。
技术普适性拓展
1.兼容标准成像系统
光谱特性（670nm发射）匹配常规GaAsP探测器，无需定制设备即可部署。
2.为深部探针设计提供范式
证实"血浆环境增强荧光"机制，为开发类似探针（如蛋白结合型染料）指明方向。
总结与展望
本研究首次证实伊文思蓝在NIR-III窗口激发下具备优异的三光子荧光特性，其高ησ₃值（520×10⁻⁸⁴cm⁶s²/photon²）、体内外光谱一致性及代谢稳定性，成功支撑了1550μm深度的活体脑血管成像，穿透全脑灰质、白质并抵达海马区。这一突破不仅为深部脑研究提供了安全、低成本的荧光标记工具，更开创了传统染料在新型光学窗口的应用先河。
未来工作可聚焦三方面：
动力学拓展：结合血流速度测量技术，研究脑血管功能与病理变化；
多模态集成：融合THG（第三谐波）等无标记成像，同步解析血管与神经结构；
疾病模型应用：针对中风、阿尔茨海默症等模型，探索血管通透性与病变关联。
伊文思蓝的深脑成像能力，有望成为揭开脑疾病机制的关键"光学探针"，推动神经科学研究进入更深维度。
声明：本文仅用作学术目的。
Tong S, Liu H, Huang J, Zhong J, Yan J, Wang H, Zhang X, Qiu P, Wang K. In vivo three-photon fluorescence imaging of mouse brain vasculature labeled by Evans blue excited at the NIR-III window. Biomed Opt Express. 2024 Dec 20;16(1):257-266.
DOI:10.1364/BOE.545987.
