不同组织透明技术在人脑三维重建的应用

大脑，人体最神秘复杂的器官，是神经科学和医学研究的核心。其神经元数量超860亿，连接形成的神经网络极为复杂。理解大脑结构与功能，对攻克神经系统疾病、揭示认知奥秘意义重大。传统研究方法有局限，磁共振成像虽能呈现大脑宏观结构，却难以展现细胞层面细节。经典组织学技术借助薄切片观察细胞，但在大脑三维重建上困难重重。近年来，组织透明化技术与先进成像技术结合，为大脑微观研究带来曙光。

目前的研究方法存在诸多局限，磁共振成像（MRI）可获取大脑宏观解剖图像，但其细胞分辨率不足，无法满足对神经元等微观结构的观察需求。经典组织学技术依靠薄切片（厚度≤100μm）能实现细胞水平的观察，然而在对较大范围脑组织乃至整个大脑进行三维重建时，面临切片间精确对齐、组织信息完整保存等难题，难以呈现大脑整体的微观结构特征。

组织透明化技术发展过程中，人类大脑组织是巨大挑战。随着年龄增长，成年人类大脑细胞内和细胞外积累大量脂褐素、神经黑色素和胶原蛋白等物质。这些物质不仅产生强烈自发荧光，干扰成像时的荧光检测，还形成紧密网络结构，阻碍探针在组织中的扩散。标准抗体难以穿透脑组织，在对大脑进行免疫染色时，很难实现均匀且深入的标记。尤其针对高密度抗原表位，如神经元核抗原（NeuN）的染色，容易导致样本标记不完整，影响图像解读和分析，使得大脑微观结构研究进展缓慢。

为克服上述难题，研究人员探索多种组织透明化方法，包括CLARITY、SWITCH、SHIELD和扩展显微镜（ExM）技术，这些技术的核心思想是通过固定剂稳定组织中的内源性蛋白质和核酸，然后通过去脂化等步骤使组织变得透明。CLARITY技术利用聚丙烯酰胺水凝胶固定组织，同时增加透明度，便于成像观察。但凝胶聚合后去除多余凝胶的操作难度大，易损坏组织样本。而SWITCH和SHIELD技术则利用不同的固定剂分子实现组织的稳定化。膨胀显微镜技术（ExM）从物理膨胀原理出发，在样本中引入特殊化学物质，使样本吸水均匀膨胀，放大微观结构，便于常规显微镜观察。该技术提高分辨率的同时减少自发荧光干扰，为大脑微观结构研究提供新方向。

为了克服CLARITY技术中水凝胶过量的问题，研究者们开发了一种“三明治”方法，将大脑切片夹在两片玻璃之间，稳定切片并去除多余的水凝胶。此外，研究者们还对透明化后的组织进行了脱色处理，以减少自发荧光的影响。这些优化措施显著提高了透明化效果和后续染色的效率。

样品处理

成像技术方面，共聚焦显微镜和光片荧光显微镜（LSFM）发挥关键作用。共聚焦显微镜能获取细胞和组织的高分辨率光学切片图像，但对厚样本成像时，存在穿透深度有限、光漂白等问题。LSFM具有快速成像、低光漂白和高分辨率的优势，适合对组织透明化后的较大体积样本进行三维成像。研究人员结合这两种技术，充分发挥各自优势，为大脑组织成像提供有力支持。

研究人员使用了来自不同年龄供体的人类大脑样本，包括前中央皮质和布罗卡区的切片。这些样本在福尔马林中固定了不同时间，以模拟实际研究中可能遇到的各种条件。

研究人员对不同厚度的大脑切片分别采用CLARITY、SWITCH、SHIELD和ExM四种方法处理，并结合NeuN抗体进行免疫标记，利用共聚焦显微镜和LSFM成像。结果显示，CLARITY技术在小鼠大脑研究有成果，但在人类大脑样本中出现了抗原掩蔽的问题，无法有效进行NeuN免疫染色。

使用共聚焦显微镜进行NeuN抗体验证

SWITCH和SHIELD技术处理500μm厚大脑切片时，能实现白质和灰质均匀透明化，部分NeuN抗体与之兼容，可用于神经元检测。对SWITCH和SHIELD处理后的样本进行LSFM成像分析发现，两种方法在样本表面附近染色效果相似，但样本中心区域，SHIELD处理的样本信号强度低，神经元计数明显少于SWITCH处理的样本。这表明SWITCH技术在500μm厚大脑切片染色和成像方面表现更优，更适合大尺度分析。

用不同的NeuN抗体标记的澄清的人脑切片的代表性LSFM图像

代表性的LSM布罗卡区域图像

对于ExM技术，研究人员在100μm厚大脑切片上实验。ExM处理后的组织自发荧光低，使用AcX处理能有效保留荧光信号。结果显示，ExM技术能有效检测神经元，样本膨胀后，信号噪声比和光学分辨率显著提高。不过，ExM技术在膨胀过程中使用蛋白酶消化原生蛋白质，导致膨胀后的样本无法直接进行多次染色和剥离实验，限制了其在部分研究中的应用。

使用ExM的NeuN抗体免疫染色验证

研究结果表明，SWITCH技术在透明化和染色效果方面表现最佳，适用于较厚的脑组织切片。而ExM技术则通过物理膨胀显著提高了成像分辨率，为研究大脑的细胞结构提供了新的视角。尽管如此，这些技术仍面临一些挑战，例如抗原掩蔽和自发荧光等问题。未来的研究需要进一步优化这些技术，以提高透明化效果和染色效率。此外，结合人工智能和大数据分析，这些技术有望在神经科学研究中发挥更大的作用，为揭示大脑的奥秘提供新的工具和方法。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于：Scardigli M, Pesce L, Brady N, Mazzamuto G, Gavryusev V, Silvestri L, Hof PR, Destrieux C, Costantini I, Pavone FS. Comparison of Different Tissue Clearing Methods for Three-Dimensional Reconstruction of Human Brain Cellular Anatomy Using Advanced Imaging Techniques. Front Neuroanat. 2021 Nov 11;15:752234.

doi: 10.3389/fnana.2021.752234.