前沿研究：在体跨尺度双光子显微成像技术的发展与应用

1930年，物理学家Maria Goeppert-Mayer指出双光子吸收的概念；1990年，博士生Winfried Denk提出了双光子激光扫描显微镜技术，对神经科学研究产生革命性影响。

双光子显微镜在厚生物组织中依然可以保持良好的空间分辨率，这一优点使得其诞生不久就被应用于在体脑成像研究。但初代双光子显微镜存在成像视野小、通量低、体积大等问题，而神经网络在时空多个维度均具有跨尺度的特点，为满足脑科学研究中在体跨尺度脑成像的需求，双光子显微镜近年来有了快速且显著的发展。

广西大学、中国科学院的研究团队在《中国光学（中英文）》发表综述文章，介绍了双光子显微镜的工作原理，并在成像视野、成像通量、成像深度、分辨率、微型化5个方面详细阐述了双光子显微镜研究的新进展。

荧光团分子吸收光能后，电子态、振动态和旋转态会改变，最终通过振动弛豫和荧光发射回到低能基态。单光子荧光效应是线性的，信号强弱与入射光强度呈线性关系，而双光子激发等非线性荧光效应中，荧光信号大小与入射光强度呈非线性关系，对激光强度敏感度更高。

高空间密度通过高数值孔径物镜聚焦激光束产生，时间上的高集中则需要使用超短脉冲激光器。双光子荧光显微镜的优势在于激发光近红外光对生物组织穿透性更强、光毒性更小，且产生的荧光信号只出现在目标区域，信噪比高。

（a）单光子和（b）双光子荧光激发原理

双光子激光扫描显微镜的结构与共聚焦显微镜类似，主要包括飞秒激光器、光强调制器、激光扫描器、显微物镜、光电探测器、中央控制器和上位机软件。

双光子显微镜的激光器多为钛-蓝宝石振荡器，其重复频率与典型的荧光寿命相匹配。共聚焦荧光显微镜收集荧光时需要针孔光阑减少串扰，而双光子显微镜荧光信号几乎只在焦点产生，焦外荧光很少，不需要额外的辅助器件来限制焦外荧光，荧光收集效率显著增强。

双光子显微镜结构示意图

成像视野

传统双光子显微镜视场通常限于大脑的单个功能区域，近年来出现了多种大视场的双光子显微镜系统。

如多区域实时双光子成像技术（MATRIEX），将物镜替换为双层复合物镜结构，实现多个分离区域的同时成像，但只能成像若干离散区域，没有实现大视野连续覆盖成像。

大尺度成像视野双光子显微镜。（a）多区域实时双光子成像技术；（b）双扫描系统双光子显微镜；（c）双扫描区域同步成像双光子显微镜；（d）多区域随机扫描双光子显微镜；

离散多区域成像方法，将两个显微镜放置在同一动物的大脑上，可提升成像面积，但对两个以上大脑区域成像会大幅增加装置成本和复杂性。

基于介观物镜的成像系统，可实现连续覆盖大视野脑皮层成像，但目前全视野和细胞分辨率下连续覆盖成像的时间分辨率仍较低。

成像通量

双光子显微镜成像通量的提高对脑神经网络机理研究具有重要意义。其成像通量可定义为每秒获取图像像素的总数，常规成像通量在百万量级。提高成像通量的传统方式是采用宽场照明结合时间聚焦，但会减弱高空间选择性，令图像分辨率和信噪比下降。

快速扫描双光子成像技术。（a）光珠双光子显微镜；（b）多焦点快速扫描双光子显微镜；（c）快速线扫描双光子显微镜

最新双光子高通量成像方法通过多焦点或线扫描实现亿级的成像通量，局部图像帧率提高到1-3kHz，如光珠显微镜，基于多焦点扫描和时分复用技术，可在鼠脑中最多同时追踪100万个神经元。

平面多焦点双光子显微镜，通过微透镜阵列产生400焦点同时扫描；快速线扫描双光子显微镜，以4个不同角度扫描二维样本平面上的焦线，通过压缩感知算法重建荧光图像。

成像深度

通过三光子或自适应光学方法，成像深度提升程度超过100%，采用侵入式的梯度折射率透镜可以将成像深度提高数倍，但对脑组织有一定损伤。

超深度探测显微成像技术。（a）梯度折射率透镜双光子显微镜；（b）三光子小鼠神经元成像；（c）三光子小鼠脑血管成像

如使用梯度折射率透镜配合双光子扫描显微镜的装置，可在任意深度对细胞进行成像，已应用于小鼠脑深处神经信号的探测。

三光子显微镜在对小鼠神经元活体成像时，最深探测深度可以达到1.4mm，如利用三光子技术呈现了小鼠脑皮层下1.4mm处的海马树突精细结构和单个神经元活动情况，以及获得小鼠皮层下2.1mm处血管的结构图像。

成像分辨率

超分辨率光学显微镜主要分为单分子定位显微镜、受激辐射耗尽荧光显微镜（STED）、结构光照明显微镜（SIM）三类。

STED显微镜通过控制光圈内环大小调整荧光激发区域，实现了5.8nm的分辨率，STED技术可与双光子显微镜结合，如Alberto Diaspro课题组开发的单一光源的STED-双光子显微镜，分辨率可达80nm。

超分辨率双光子显微镜。（a）STEM成像原理和实验数据；（b）SIM结构光生成方法和结构光与均匀光照射探测精度对比

SIM成像技术通过改变照明光空间结构，将样品中不可见的高频信息携带到显微镜的可见低通频带，再通过傅立叶变化提取高频信息并重建出超分辨率图像，SIM可结合双光子技术，如Qionghai Dai课题组采用的SIM结合双光子技术，横向分辨率可达141nm，还有一种方法横向分辨率可达208nm，且SIM成像速度快，使用低强度光源可减少光漂白的可能性，也可配合自适应光学方法使用。

设备微型化

头戴式微型双光子显微镜可以使实验动物在自由移动的状态下进行成像。

如程和平团队研制的微型化双光子显微镜探头质量只有2-3g，可长时间记录小鼠在剧烈运动下的神经元活动。

超分辨率双光子显微镜实验结果

Emily A Gibson使用微型化头戴式双光子显微镜对小鼠脑血管进行连续17天的观测。

Edvard I Moser团队开发的微型化双光子MINI2P系统，不足3g，可以对自由小鼠多平面实现1000个神经元钙成像，揭示不同脑区细胞的空间联系。

目前的多光子显微成像技术大多仅在1-2个维度实现了跨尺度跨量级的技术指标突破，尚未在多个尺度同时实现跨量级提高。

例如：使用梯度折射率透镜能提高成像深度，但存在有损植入、自身视野有限等问题；三光子技术无需破损皮层就能对超过1mm深度的区域进行成像，但低重复频率会限制成像通量；线扫描结合压缩传感进行图像重建对样品有一定限制，多焦点同时扫描是目前最佳的方案，但也存在一些问题，如焦点荧光信号区分、成像深度增加导致散射程度提高等；微型化双光子显微镜目前局限在1mm以内，应用这些微型光学器件进一步提高成像速度和通量也极为困难。

双光子显微镜在多个尺度方向的性能提升进展现状

结合STED技术可以大幅提高双光子成像分辨率，但在大视野范围内保持耗尽圆环光斑与激发圆斑对齐比较困难；双光子技术与SIM结合可以提高分辨率，但会降低成像速度。

为了实现大脑在体大视野高分辨率高通量成像，未来需要发展大视野高分辨介观物镜，结合三光子技术和自适应光学方法扩展成像深度，同时研究提高成像通量的新技术，采用多焦点技术并结合时分复用技术和阵列探测器，还要考虑热效应和荧光探针效率等因素。

自双光子显微镜诞生以来，在体脑成像研究的需求促使双光子显微镜在成像视野、成像通量、成像深度、分辨率、微型化等多个维度上性能指标有所提升。

总的来说，目前双光子显微镜在各个维度上均分别有了跨量级的发展，但仍未实现多个维度同时跨量级突破。

量变产生质变，相信在不久的将来，将出现真正意义的在体跨尺度双光子显微成像技术，并在突破解析大脑“黑盒子”内部工作原理的过程中起到关键作用。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于CHEN Shuai, REN Lin, ZHOU Zhen-qiao, LI Min, JIA Hong-bo. In-vivo across-scales two-photon microscopic imaging technique[J]. Chinese Optics, 2022, 15(6): 1167-1181. doi: 10.37188/CO.2022-0086.如涉及版权问题，可联系工作人员删除处理。