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先进成像 | 单物镜光片显微镜三维荧光成像技术研究进展

 

 
 
 
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光片显微镜可以做到快速三维成像,同时其光毒性相较于共聚焦或多光子成像降低了3个数量级,使针对活体的长时间成像成为可能。光片显微镜可以根据不同的应用场景进行定制,迅速在生物学研究中普及,用于胚胎发育学、神经生物学、肿瘤学等多领域,是活体长时间三维成像的巨大进步。

光片显微镜由于具有强大的光学层切能力、较快的成像速度和较低的光损伤,成为三维成像的重要工具。光片显微镜通常利用两个垂直放置的物镜分别进行照明和成像,这带来了对样品的空间限制并禁用了高数值孔径的成像物镜。以倾斜平面照明和微镜微器件反射技术为代表的单物镜光片显微技术突破上述限制,展示出在高分辨率和体积高速成像方面的优势,并且可与超分辨显微术等多种技术结合,在近年来取得了巨大发展。

 

本文介绍了不同类型的单物镜光片显微成像技术的原理、关键性能的提升和其在生物医学的应用。

 

 
 

 

 
倾斜平面照明显微镜

1.1 倾斜平面照明显微镜的实现原理

传统的选择平面照明显微镜由两个正交的物镜构成,双物镜的放置占用了几何空间,不适用于盖玻片样品的成像。使用一物镜引入光片的同时使用另一个相同物镜进行成像则可以解决上述问题。Konopka等设计了可变角度的落射光荧光显微镜,使用与成像同一个高NA的物镜输出可变角度的倾斜照明光,减少了荧光背景,提高了信噪比。

 

Tokunaga等利用高度倾斜和层压光学片显微镜,使用细的倾斜光束对细胞中的单个分子进行成像。这样斜入射的照明光可以增加图像的对比度,降低了光漂白程度,但这种显微镜照明光束从物镜光瞳边缘入射,照明方向与焦平面成一定倾斜角度,由于倾斜面像差的存在,真正能用于成像的只有焦平面与照明光束所相交的那条“线”,而不是面。

 

图1 倾斜平面照明显微镜光路,用同一物镜生成光片并成像,引入远程聚焦系统修正照明角度倾斜

 

为了解决倾斜照明平面与焦平面不重合的问题,2008年Dunsby发明了倾斜光片照明显微镜。如图1所示,将柱透镜生成的片状照明光引入原先探测物镜的光路中,在成像光路中设计了一种远程聚焦系统,引入二级和三级物镜在无球差的条件下对样本三维信息在第二、第三物镜之间进行复制,再通过三级物镜进行成像。两台显微镜提供的总放大倍数在轴向和横向上都是相等的(折射率匹配)。

 

1.2 倾斜平面照明显微镜的生物医学应用

光片显微镜自出现以来,依靠极低的光毒性常被用于活体胚胎等大样本的长时间发育成像等。光片显微镜的成像限制也成了研究人员开发单物镜光片的初衷,单物镜光片显微镜的发展不仅增加了生命科学研究人员的使用便利性,也拓展了生命科学中多种之前不可能实现的场景中的应用,使光片显微镜在活体成像上的优势更为明显

 

图2 倾斜平面照明显微镜用于快速生命活动成像。(a)OPM实现对心脏中钙火花的3D成像;(b)OPM实现对心肌收缩钙波传播的观测;(c)SCAPE 2. 0以321volume/s的体积成像速度实现对心脏与心房间的血流动力学观测

 

图3 OPM在生命科学与医学检查场景的广泛应用。(a)OPM的高分辨率成像;(b)OPM用于流式细胞检测;(c)DaXi-OPM实现对9个斑马鱼胚胎的同时成像;(d)Medi-SCAPE用于活体肿瘤检测;(e)利用人眼作为天然物镜,实现对眼底视网膜成像

 

单物镜光片显微镜将振镜扫描的方式带入光片显微镜的三维成像,将体积成像速度带入新的量级,使体积成像可以只受相机帧速限制。这在很多高速生命活动如神经活动、心脏跳动及血流动力学等方向需要毫秒级时间分辨率的观测是充满希望的。

 
 

 

 
基于微镜反射的单物镜光片显微镜

倾斜平面显微镜是最普遍的单物镜的光片显微镜,但是存在倾斜切面引入非各向同性的PSF、需要额外的远程聚焦系统的问题,这使显微镜结构复杂化。除了倾斜照明平面显微镜,另一类的单物镜光片显微镜则借用了45°反射微镜,这一类光片显微镜用同一物镜发射垂直于光轴的照明光片,可以用CMOS/CCD直接成像,不再需要额外的远程聚焦系统。

 

2.1 针尖微悬臂反射镜

早先原子力显微镜悬臂的45°镜面的反射可以使光片与焦平面对准。2013年Gebhardt等开发了一款利用原子力显微镜(AFM)臂的反射型光片显微镜,斜入射的光片在壁上反射照明样品。受到悬臂反射的启发,2018年Ponjavic等利用原子力显微镜的单臂开发了一种只使用一个物镜的光片显微镜,将原子力显微镜的单臂当作反射界面,也实现了单物镜光片照 明。Li等将AFM的显微镜单物镜光片与纳米移液器结合,进行了精确单分子递送研究。这一类显微镜的优点是可以使用高NA物镜对多孔板进行成像,并且在移动位移台时不需要对样品进行重新聚焦。

 

2.2 微流控制备微反射镜器件

2015年Galland等设计了一款不需要远程聚焦系统、光片方向垂直于物镜光轴的单物镜光片显微镜,该单物镜光片显微镜的光路如图8(a)所示。该显微镜使用了一种定制的样品装载容器,将45°反射微镜结合在硅片的微孔里。照明光束从物镜后焦面上斜入射,经45°微镜反射后形成垂直于光轴的照明光片。该单物镜光片显微镜可以与倒置商用标准显微镜兼容,同时10×到100×物镜都可以使用,生成的光片厚度为1.5~5.2µm,可以方便多种尺度的研究。该系统既可以使用振镜扫描光片,如图4(a)所示y方向振镜扫描,也可以使用柱透镜生成静态光片。

 

图4 微镜反射的单物镜光片显微镜。(a)基于45°微镜的单物镜光片显微镜的光路,右上角为扫描电子显微图像;(b)利用ETL进行轴向位移,使光片中心横向位置保持不变

 

 
 

 

 
单物镜光片显微镜的超分辨成像拓展

超分辨显微术是一种突破传统显微镜分辨率极限的技术,可以将物体结构的分辨率提高到亚细胞水平。现代的超分辨显微术包括了多种技术,如激光受激发射显微术(STED)、包括stochastic optical reconstruction microscopy(STORM)和NA-based point accumulation for imaging in nanoscale topography(PAINT-DNA)等的单分子光学显微术(SMLM)、结构照明显微术(SIM)。依据瑞利判据可分辨的最小范围为200nm,而超分辨显微镜的出现突破了该极限,超分辨显微镜是近代光学显微镜中最浓墨重彩的一笔。光片的照明方式对多种超分辨方法具有潜在的增益,这十几年间二者深深地联系在了一起。

 

3.1 单物镜光片显微镜的单分子定位超分辨成像

典型的单分子方法如STORM的原理是:利用荧光染料的发光特性,对荧光染料以少量随机分布的方式激发,然后对发光的荧光染料单个分子进行定位。通过多次成像,将每个分子的位置累加起来,就可以得到分子分布的高分辨图像。单分子超分辨方法中,荧光信号是微弱的。图像的信噪比越高,单分子定位的精度就会越高。传统照明方法具有高背景荧光,高信噪比也是光片显微镜的优势之一。一般的单分子显微镜只能将成像范围限制在表面样品,但与光片显微镜结合后,可以将厚样本纳入研究范围。

 

3.2 单物镜光片显微镜的结构光照明超分辨成像

在上述几种超分辨成像方法中,SIM超分辨显微术具有相对较快的速度,与光片技术都常用于活细胞的成像场景。要想实现各向同性分辨率增益的结构光显微成像,则需要在三个方向上拍摄3张相位相差π/3的图像,利用9张图片重建获得超分辨图像。但如何在光片显微镜中实现频率满足周期性的条纹一直是一个难点。

 

图5 结合单分子定位方法的单物镜光片显微镜。(a)soSPIM-PLAM成像,左边宽场,右边超分辨;(b)soSPIM-dSTORM超分辨成像,左边宽场,右边超分辨;(c)组织深度为50μm的代表性体积obSTORM图像,十张图像堆叠,深度颜色编码;(d)obSTORM高倾斜角度的光片入射;(e)光片角度下理论和实验PSF的对比。

 

 
 

 

 
结语与展望
 

光片显微镜自问世以来,由于其真实物理意义上的光学切片以及与各种光学技术的适用性迅速流行起来,并在十多年间发展突飞猛进。单物镜光片显微术作为一种新兴的体积成像方法具有诸多优点。单物镜光片显微镜解决了传统光片显微镜不可用载玻片的问题,并释放了几何空间的限制,同时解决了正交光片显微镜不能使用高NA物镜的问题,联合超分辨成像技术后,光片显微镜分辨水平得到进一步提升。单物镜光片显微镜推动了光片显微镜在生物学实验室的应用,单物镜光片显微镜由于具有快速成像和活细胞成像的特点,特别适用于对一些神经信号、血流等高速生命活动的观察,并且可以用于一些在体成像场景,是一种快速体积成像利器。

 

当然单物镜光片显微镜很多仪器部件都需要特殊定制并且许多部件价格昂贵,这无疑增加了单物镜光片的使用成本,限制了单物镜光片的推广,在这一方面还需要研究人员继续开发低成本光片显微镜。同时,在光片显微镜发展的过程中,往往一台光片显微镜难以满足多种应用场景的需求,一些新型单物镜光片显微镜可以结合在倒置显微镜上,满足多种尺度成像需求,这有利于光片显微技术走进更多生命科学研究人员的实验室。

 
 

 

 
拓展知识——光片显微镜优势
 

1.1 低光毒性、光漂白性与低光损伤

光毒性(phototoxicity)是指在较长时间的强光照射下,生物样本细胞内的荧光分子会产生分解现象,这是利用激光作为光源进行显微观测时无法避免的。光漂白(photobleaching) 指的是荧光分子在光照下荧光褪色减弱的过程,几乎所有的荧光团在光照下都会出现褪色。光损伤(photodamage)是指长时间或是高剂量进行激光扫描样品,令样品细胞内荧光分子受到破坏的现象。光毒性、光漂白和光损伤是荧光显微镜、共聚焦显微镜观察样本常面临的负面效应。而光片显微镜侧向照明的方式使其只需照亮观测平面即可观测所要观测的成像面,使得光毒性和光漂白效应降低几个数量级,解决了共聚焦显微镜成像时无法长时间持续观测的问题。

 

1.2 高时空分辨率

不同于共聚焦显微镜采用光电倍增管(PMT)探测,光片显微镜采用了宽视场的图像采集器:科研级互补金属氧化物半导体相机(sCMOS)进行逐面成像,使得被激发光所照射的平面所有的荧光信号都能被检测到。光片显微镜结合精确的采样定位系统便可以快速地获得样品多层次的光学切片,还可在低光毒性的基础上对活样本同时进行长时间的多色、多视角成像。

 

1.3 支持活体、活细胞、完整胚胎器官成像

光片显微镜采用的正交光路设计,使其具有较大的观测空间,可以观测较大的样本,其样品可以是较大尺度的哺乳动物的完整胚胎、器官等,也可以观察如秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇、斑马鱼和小鼠等模式生物的动物活体胚胎;同时高分辨的光片显微镜还可进行对于活细胞和亚细胞结构的长时间观察。

 

1.4 拓展性和适用性强,易于改进和优化

常见光源的光是容易产生衍射和散射问题的高斯光束(Gaussianbeam)存在观测视场与轴向分辨率相互制约的问题,利用艾里光束(Airy beam)或贝塞尔光束(Bessel beam)等方式来代替传统的高斯光束来产生光片,显著增强了高散射的大型生物样品的体内细胞分辨率三维成像的信号对比度和成像深度。目前针对不同的具体研究条件产生了以正交光路设计为核心的一系列光片荧光显微镜:近红外二区光片、多向选择性层状光照明显微镜(mSPIM)、特殊设计的水浸式倒置光片、数字扫描激光光片显微镜(DLSM) 、单分子倾斜平面显微镜(obSTORM)等。

 

通过PubMed查询关键词“lightsheet”、“selective plane illumination,2021年11月已经有1725篇相关文献;截至2020年12月,被Web of Science数据库收录的以“lightsheet fluorescence”或“selective plane illumination”为关键词的文献已有超过2200篇,包括但不限于对光片荧光显微镜的改进和应用。这表示近年来光片显微成像技术得到了极大的发展和应用;这些创新和改进的光片显微成像技术,极大丰富了科研人员的生物样品成像方式,使得我们更加深入了解和感知生物体的生命活动规律。

 

 

 

此外,近年来国外内很多实验室都在进行光片显微技术开发,如利用超构表面生成光片和超分辨光片荧光显微技术:晶格光片显微技术、相干结构照明光片显微技术、受激辐射损耗光片显微技术、随机光学涨落成像光片显微技术等,这些技术正在积极探索之中,它们的突破有望改变光片荧光显微系统构架并极大拓宽在生命科学、基础医学、临床医学等方面的应用。

 

比较几种超分辨光片显微技术:(a)晶格光片;(b)相干结构照明光片;(c)受激辐射损耗光片;(d)随机光学涨落成像光片

 

扩展内容来源:罗辑科学(微信公众号)

 

 

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